TCR/BCR repertoire analysis

레퍼토리분석에 대한FAQ

neoepitope analysis

Coming Soon

Bacterial Flora Analysis

Flora Analysis FAQ

 

레퍼토리분석에 대한FAQ

기본정보

레퍼토리란 무엇입니까?
면역계통에서 주요한 면역세포인 T세포와 B세포는 다양한 항원의 자극에 의하여 각각 다른 특이성을 가진 T세포수용체 (TCR)와 B세포수용체(BCR)를 세포표면에 발현합니다. 이 특이적인 TCR과 BCR을 가진 림프구집단을 TCR/BCR레퍼토리라고 합니다.

면역세포의 레퍼토리란 무엇인가요 ?

레퍼토리는 어떻게 생기는 것입니까?
면역체계는 각기 다른 항원의 자극에 의해서 T세포와 B세포의 유전자가재구성 및 체세포슈퍼 돌연변이라는 메커니즘을 통하여 다양한 TCR과 BCR을 만들어져 러퍼토리가 형성됩니다. 유전자재구성은 주로 림프조직 (B세포는 골수에서, T세포는 흉선에서)에서 발생합니다.
레퍼토리의 규모는 어느 정도입니까?
세포수용체 TCR는 1018에 달아고 BCR는 1014에 달하는 것으로 추정되고 있습니다

분석기술

레퍼토리분석란 무엇입니까?
레패토리분석은 TCR과 BCR를 구성하는 V유전자와 J유전자의 사용빈도와 CDR3영역*의 염기서열을 분석하는 방법으로서 TCR와 BCR 특이성과 다양성을 명확히 해명할수있는 분석입니다. TCR과 BCR유전자의 염기서열을 결정하기 위하여 당사는 독자적으로 개발한 비편향유전자증폭법을 이용함으로서 레퍼토리분석을 보다 셈세하고 정확히 진행할수 있습니다.
* CDR3 영역 : 상보성결정영역. TCR에서는 항원펩타이드를 BCR에서는 항원을 직접 결합하는 영역을 의미하며 수용체의 다양성이 특히 높은 영역으로 인식되고 있습니다.

레퍼토리 분석에 관하여

레퍼토리분석은 어느 수용체를 분석하고 있습니까?
당사의 레퍼토리분석에서는 T세포수용체(TCR)에서는 α, β, γ, δ 사슬의 4 종류, B세포수용체(BCR)에서는 중쇄의 5종류 (μ(IgM), γ( IgG), α(IgA), δ(IgD), ε(IgE)), 경쇄의 2종류 (λ(IgL), κ(IgK))를 분석하고 있습니다.
Adaptor-Ligation PCR (AL-PCR)에 대해서 알려주십시요.
AL-PC은 유전자의 5’말단에 어댑터서열을 연결하고 어댑터와 유전자의 정상영역(C영역)에 설계한 한쌍의 프라이머를 이용하여 PCR증폭을 실시합니다. AL-PC법은 모든 TCR 또는 BCR유전자를 비편향증폭을 할수있는 방법입니다. 자세한 내용은 기술소개 페이지를 참고하여 주십시오.
다른 기술과 비교하여 어떤 우점들이 있습니까?
당사의 AL-PCR법은 유전자를 증폭할때 바이어스가 발생하지 않습니다. 그리고 골드표준법인 유동세포계측법(FACS)등 방법으로 분석한 결과와 상관성이 매우 높습니다. 다른 한편 흔히 사용되는 Multiplex PCR법은 V유전자와 J유전자의 여러가지 프라이머를 혼합하여 동시에 사용하기 때문에 각 프라이머 사이의 증폭효율의 차이에 따라 PCR바이어스가 발생합니다. 또한 BCR의 V유전자와 J유전자는 체세포슈퍼돌연변이가 자주 발생하기 때문에 설계한 프라이머와 주형간의 서열이 일치하지 못하기때문에 유전자의 PCR증폭이 잘되지 않습니다. AL-PCR에서는 변이가 일어날수 있는 영역에 프라이머를 설계하지 않았기 때문에 레퍼토리를 정확히 반영할수 있다는 점이 장점입니다.
유동세포계측법 (FACS) 방법과 비교하여 무엇이 다릅니까?
FACS를 이용한 레퍼토리분석 TCRVβ사슬에 대한 항체을 사용하고 있습니다. 현재 사람의 레퍼토리분석을 할때 항체로 약 70 % 정도의 Vβ체인을 분석할수 있습니다만 Vα체인인경우에는 상응된 항체가 없으므로 분석이 불가능합니다. 또한 FACS법는 많은 세포가 필요하기 때문에 분석 제한을 받을뿐더러 조직에 침유되여 있는 T세포(TIL)의 분석에 대해서는 적합하지 않습니다. 당사의 레퍼토리분석은 시료에서 추출한 Total RNA를 이용하기 때문에 다양한 시료의 분석이 가능합니다.
차세대염기서열분석법으로 시퀀서를 실시한 다음 바이오인포매티스 소프트웨어로 데이터베이스와의 상동성검색, CDR3아미노산서열의 변화와 리드수의집계를 하기때문에 모든 V유전자를 망라할뿐만 아니라 J유전자의 레퍼토리, CDR3아미노산의 서열을 포함한 클론발현빈도의 분석까지도 가능합니다. 그리고 당사의 레퍼토리분석결과는 FACS분석결과와 상관성이 매우 높은 것을 확인함으로서 FACS으로 레퍼토리분석을 하고 있는 연구자들도 안심하고 이용하실수 있습니다.
귀사에서 사용하는 시퀀서에 대해 알려주십시요.
당사에서 사용하는 기기는illumina사의 MiSeq입니다.
시퀀스의 데이터분석은 어떻게 하십니까?
당사에서는 독자적으로 개발한 레퍼토리분석용 소프트웨어Repertoire Genesis를 사용하여 시퀀스결과를 자동으로 분석합니다. 시퀀스에서 얻은 매개의 리드를 V유전자, J유전자 데이터베이스와 상동성검색을 실시하는 한편 CDR3영역의 아미노산서열을 검증합니다. 공통 리드를 집계함으로서 검체에 포함된 상위클론 순위을 결정합니다. 또한 V유전자와 J유전자의 크로스를 집계한 3D그래프를 생성할수 있습니다. 크로나리티의 분석에 유용한 CDR3길이는 CDR3서열을 이용하여 디지털CDR3 Spectratyping으로 재현할 수 있습니다.
TCRV사슬 유전자의 이름을 잘 모릅니다.
TCRV사슬의 명명법은 여러가지 방법이 있고 각 명명법에 의해서 TCRV사슬의 순서도 다릅니다. 상세한 내용은 the international ImMunoGeneTics information system® (MGT®)에서 확인하시기를 바랍니다. 예전에는 FACS분석용 항체를 사용함으로서 Vβ표기가 되여 있었지만 현재는 게놈유전자의 위치에 따라 번호를 매긴 IMGT분류법(TRAV과 TRBV로 표기)이 주로 쓰이고 있으며 당사에서도 이런 분류법에 따라서 표기하고 있습니다.
레퍼토리분석 소프트웨어에 대해서 알고 십습니다.
당사에서 차세대시퀀서에서 출력된 데이터를 자동적으로 빠르고 정확하게 처리할수 있는 레퍼토리분석용 프로그램(Repertoire Genesis)를 독자적으로 개발하였습니다.

레퍼토리분석 의뢰에 대하여

검체의 양은 어느정도가 필요하신가요?
레퍼토리분석는 시료중의 림프구를 분석대상으로 합니다. 건강한 사람의 혈액이면 5mL(말초혈액단핵세포 5 × 106 )정도 임파조직이면 100mg정도이면 분석이 가능합니다. 피부조직과 같은 다른 조직을 분석할때에는 검체양을 늘려야합니다. 또한 특정 세포를 CD4와 CD8등 특정 세포인경우에는 1~10만개의 세포이면 가능합니다. 당사에 연락하시면 구제적 검체채취양에 대해서는 상담을 드릴수 있습니다.
우리가 직접 추출한 RNA으로 레퍼토리분석을 할수 있습니까?
고객님의 직접 추출한 RNA으로 레퍼토리분석이 가능합니다. 당사에서는 레퍼토리분석을 시작하기전에 Agilent사의 TapeStation으로 RNA품질검사를 합니다. RINe치가 너무 낮을경우 (1 ~ 5)에는 기대한 결과를 얻지못할 가능성이 있으므로 서열분석을 하기전에 고객님과 상담하고 분석실시 여부를 결정합니다. 분석이 중단하는 경우에서는 RNA품질검사비용만 청구합니다.
게놈DNA로 레퍼토리분석을 할수 있습니까?
당사의 레퍼토리분석은 total RNA로만 분석을 시작하기 때문에 게놈DNA분석은 하지 않습니다.
분석용 조직의 보관방법을 가르쳐주십시요.
분석용 조직은 RNA 안정화시약 (RNA later)에 잠그어 보관하는 것이 좋습니다. 자세한 방법은 당사의 프로토콜을 참고하여 주십시오 (링크).(link (Japanese))。
레퍼토리분석후 검체은 돌려 줄수있습니까?
원칙적으로 검체는 돌려드리지 않습니다. 분석후 남은 Total RNA는 돌려드릴 수 있습니다.
검체는 어떻게 보내면 되십니까?
당사의 검체배송 프로토콜을 참고하시고 보내주십시요 (링크).(link (English))。
분석기간은 얼마 걸립니까?
보통 1 ~ 2개월 정도가 걸립니다. 검체을 접수한후 분석일정을 잡습니다만 상황에 따라 변동될 가능성도 있습니다. 학회나 잡지의 논문투고 마감일때문에 급하신 분은 당사와 연락주시면 별도로 상담을 드릴수 있습니다.
시퀀서를 점유해서 분석의뢰가 가능하신가요?
차세대시퀀서는 대량의 데이터를 얻을수 있기때문에 식별서열 (index서열, MID서열)을 부가하고 많은 샘플을 동시에 서열분석을 하고 있습니다. 주문 샘플수가 적어 1회run에 채우지 못할 경우에는 다른 샘플과 함게 서열분석을 합니다. 시퀀서를 점유해 분석을 원하시는 분은 당상와 연락하여 별도로 상담하여 견적을 보내 드리도록 하겠습니다.
리드수는 얼마나 얻으면 좋습니까?
필요한 리드수는 분석대상에 따라 다릅니다. 다양성이 높은 시료인경우 0.001 %의 특정TCR유전자를 검증하기 위해서는 10만이상의 유효리드수가 필요합니다. 실제 시퀀스할때에는 유효리드수의 1.5 ~ 2배 정도의 총리드수가 소요됩니다. 다른 한편 T세포클론의 TCR유전자를 확인할 경우에는 1,000리드 정도이면 충분하다고 생각됩니다. 당사는 MiSeq를 사용함으로서 유효리드수를 10만이상의 리드를 목표로 하고 있습니다. 이상은 참고로 하시고 분석의뢰시에 분석목적에 대해 상담을 드리고 분석리드수를 별도로 조정할수 있습니다.

레퍼토리분석 결과에 대한 평가

분석결과의 보는 방법에 대해 가르쳐주십시요.
2D그래프는 검체에 존재하는 TCR 혹은 BCR의 V유전자 혹은 J유전자가 얼마나 들어 있는지를 보여 드립니다. 대조시료사이에서 들어있는 수용체빈도를 비교함으로서 상호간의 차이를 찾을 수 있습니다. VJ유전자의 3D그래프는 TCR 혹은 BCR에서 V와 J유전자 가 조합한 수용체빈도를 보여줍니다. 부감으로 전체 레퍼토리을 더 쉽게 볼수있습니다. 특정된 VJ유전자의 사용빈도의 증가로부터 크로나리티의 변화를 한눈에 확인할수 있습니다. 집계순위는 검체중에 존재하는 TCR 또는 BCR의 독특한 리드의 대해 코피순으로 랭킹을 하고입니다. 다양성이 높은 경우에는 코피수가 낮고 크로나리티 높은 경우에는 높은 코피수자를 나타내고 있습니다. 관심있는 수용체의 CDR3서열을 검사하는 동시에 다른 검체에 존재하거나 증감하고 있는지 등 분석대상과 목적에 따라 다양한 비교를 할수 있습니다. 귀하께에서 이에대해 의문사항이 있으시면 당사에 연락을 부탁드립니다.
3D그래프에서 피크가 높은 순위에서 상위에없는 이유는 무엇입니까?
VJ유전자의 3D그래프는 조합한 VJ유전자의 빈도를 표시합니다. VJ유전자가 조합해도 CDR3서열이 다른 유전자가 포함되면 3D그래프에서의 다른 피크보다 높지만 실제로는 여러가지 클론이 포함되여 있기때문에 랭킹순위에서는 뒤떨어지고 있습니다. 크로나리티에 대해 평가할때 최종순위 확인하셔야 합니다.
검체간의 비교는 어떻게 실시해야합니까?
분석결과를 보는 방법은 모두 비슷합니다만 비교하는 검체사이에서 2D 또는 3D그래프에서 사용빈도를 비교할 수 있습니다. 랭킹데이터를 이용할때에는 관심있는 클론의 CDR3서열을 이용하여 목적 검체의 전체서열에 대해 검색을 하시면 보다 효과적이라고 생각합니다. 문의사항이 있으시면 당사에 연락을 부탁드립니다.

 

Bacterial flora analysis FAQ

What are bacterial flora?
A great variety of bacteria exist in nature. Very few of these bacteria exist as a lone species in a given environment; instead there is a great variety of bacterial species. For example, it is known that in the feces, oral cavity, soil, and rivers, there exists fixed bacterial flora comprising more than 1,000 kinds of bacteria.
What is bacterial flora analysis?
This is an analysis method for specifying the distribution and species of the bacteria in a fixed environment.
What is the subject of this analysis?/dt>
We use a method that comprehensively and efficiently analyzes the bacterial species and distribution, whereby we extract the genomic DNA from bacteria in the sampled specimens, perform sequence analysis of the 16S rRNA -a characteristic sequence which is conserved across bacterial strains-, and clarify the bacterial flora based on the subtle differences between bacterial species.
Is this superior to other techniques?
In conventional methods, the specimen would be diluted and then plated on, for example, nutrient agar, to isolate bacteria individually. Then, various bacterial detection tests and 16S rRNA gene sequence analysis would be used to identify the individual bacteria. Another method was to amplify the 16S rRNA gene using PCR, digest with restriction enzymes, perform electrophoresis, and identify bacterial flora by differences in the position of the resultant bands. However, these methods had problems, such as the fact that the number of bacterial species that could be identified at once was limited from a few species to around 100 species and, while it was possible to indirectly analyze changes in the bacterial flora, it was not possible to identify bacteria definitively.
In “flora genesis” 16S rRNA bacterial flora analysis using next generation sequencers, it is possible to comprehensively analyze and identify from several thousand to several tens of thousands of bacterial species in specimens and test samples at once. Compared to conventional methods, it is possible to obtain orders of magnitude more data on the bacterial flora.
How is this different from meta-genome analysis?
The so-called meta-genome analysis is a method that uses next generation sequencers to analyze all the bacterial genomes within a sample simultaneously. While this gathers an exceptionally large amount of data, it increases the occupancy of sequencers for each specimen, and is thus very expensive. In the broader sense, 16S rRNA bacterial flora analysis is also a meta-genome analysis; however, since it is limited to the analysis of only part of a gene sequence, several specimens can be loaded for a single next generation sequence analysis, reducing the cost for this process. It is necessary to use appropriate methods to suit the aim of the study.
What region of the 16S rRNA is amplified?
In our company’s bacterial flora analysis, we mainly use the V3-V4 region as the target of our analysis. We can also analyze the V1-V2 regions, or other regions, tailored according to your needs.
What kinds of sample can be analyzed?
In principle, if the specimen contains bacteria, analysis is possible. Most specimens are feces or saliva, etc. Other specimens, such as bacterially infected human or animal tissues can also be analyzed; however, since mixtures containing host DNA are difficult to analyze, please contact us beforehand for such cases.
What methods are used to prepare and transport the samples?
>In bacterial flora analyses, we observe the distribution of the bacteria contained in the sample. Consequently, it is necessary to avoid conditions that allow for the proliferation of bacteria as much as possible. At our company, we generally recommend immediate freezing. Additionally, we also ask that shipping to our company be made via frozen delivery.
How much sample is required?
This depends upon the amount of bacteria in the sample. For feces, around 100 mg (about soybean size), and for saliva, around 500 µL are required. Since amounts vary depending on the specimen, for other specimens, please contact us.
What model of sequencers do you use?
Our company uses Illumina MiSeq.
How is the sequence data analysis performed?
Based on Fastq data obtained from sequence analysis, our in-house bacterial flora analysis software conducts primary analyses, including a dendrogramatic analysis, distribution mapping, and ranking.
What kind of data do you provide?
We provide the Fastq data obtained from the sequences and the primary analysis data from the bacterial flora analysis software. As an optional service, we also provide secondary analysis data to customers who request for them.
What kind of analyses can you provide as optional services?
We can provide diversity analysis, principal components analysis, and multivariate analyses. By conducting complex analyses, such as whether a relationship exists between clinical data and data from other analysis and the bacterial flora analysis, it is possible to extract significant data.
Is the analysis software original?
Yes, that is correct. The development was conducted in collaboration with BITS Co., Ltd., and the software can output consumer-friendly reports and perform association analyses between multiple factors including TCR/BCR repertoire analysis.
How long are the turn-around times?
The process generally takes 1-2 months. This is because multiple samples undergo sequence analysis at the same time, and varies depending on how busy the process is. We provide separate estimates for cases that need to be completed quickly or separately.
What are the read numbers for sequencing?
We conduct the sequence analysis with the aim of making 50,000-100,000 reads. Because multiple specimens undergo sequence analysis at once, it is not possible to specify a read number; however, it is possible to limit the read number during analysis.
Please provide an overview of the analysis results.
In addition to the client’s information and specimen information, the bacterial flora results report includes data on the bacterial flora of the particular sample, such as data on the detected bacterial distribution, and ranking data, as well as detailed information, such as comparative data that analyzes differences between samples.
How should I compare between samples?
For those who have requested multiple samples, we provide a range of distribution map representations for multiple samples. Additionally, we recommend % comparisons by bacterial species, based on the ranking data. These are conducted during the primary analyses; however, for complex, secondary analyses such as multivariate analysis, please contact us.